雙光子激發(fā)熒光的優(yōu)勢(shì)就是相比共聚焦使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，所以對(duì)于組織而言有著更小的傷害，同時(shí)，穿透力更深！共聚焦的成像深度普遍在100μm，而雙光子可以達(dá)到250μm-500μm，有些甚至能夠達(dá)到1mm。另外，同時(shí)吸收雙光子僅僅在一個(gè)焦點(diǎn)處，所以不會(huì)損傷焦平面以外的組織，并且成像更清晰！

更短的脈沖會(huì)產(chǎn)生更亮的信號(hào)

多光子和高次諧波等非線性依賴于脈沖激光峰值功率。峰值功率的提高，增加了同時(shí)發(fā)生多光子吸收的概率。例如雙光子熒光與三光子熒光信號(hào)分別與入射光強(qiáng)度的平方和三次方成比例。對(duì)于激光器峰值功率的增加，相應(yīng)的激發(fā)熒光信號(hào)隨之增加。低于50fs的脈沖寬度能夠明顯提高多光子效率和高次諧波產(chǎn)生效率，進(jìn)而明顯提高成像質(zhì)量（亮度）。如下圖所示，展示了雙光子（SHG）和三光子（THG）信號(hào)強(qiáng)度與脈沖持續(xù)時(shí)間[1,2](SHG強(qiáng)度-1/τ)之間的關(guān)系。

值得一提的是，如果顯微鏡光學(xué)器件中的色散沒有得到適當(dāng)補(bǔ)償，脈沖將被拉伸，并且將在樣品處測(cè)量較低的峰值功率。在這種情況下，脈沖持續(xù)時(shí)間和高次諧波產(chǎn)生效率之間的關(guān)系無法通過實(shí)驗(yàn)精確驗(yàn)證。為了產(chǎn)生足夠的非線性SHG和THG信號(hào)，以在對(duì)樣本溫和的平均功率水平下實(shí)現(xiàn)所需的信噪比，50 fs以下的脈沖和色散預(yù)補(bǔ)償?shù)氖褂檬潜夭豢缮俚摹?/p>

50fs光纖飛秒激光器——VALO系列

雙光子吸收和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求及其強(qiáng)的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑的大小和激光器脈寬。聚焦光斑越小、脈寬越窄、雙光子吸收效率越高！

基于光纖激光器——VALO，其具有靈活性、易用性和低維護(hù)成本。是現(xiàn)代雙光子成像領(lǐng)域得力光源！緊湊型VALO Aalto和VALO Tidal激光器以30MHz的重復(fù)頻率提供＜50fs的脈沖，單脈沖能量分別是6.6nJ與66nJ，平均功率分別為200mW與2000mW。光束質(zhì)量無對(duì)準(zhǔn)的高質(zhì)量光束（Aalto的典型M²＜1.1，Tidal的典型M²＜1.2）并且集成了色散預(yù)補(bǔ)償模塊。

VALO飛秒激光器采用被動(dòng)冷卻方式、不需要水冷與風(fēng)冷散熱。并且前面提及，超短脈沖和更好的光束質(zhì)量，可以擁有更高的光子轉(zhuǎn)換效率、并且較低的平均功率對(duì)于觀察活體細(xì)胞而言，對(duì)細(xì)胞或組織的損傷更低。

VALO系列飛秒光纖激光器

<50 fs 脈沖持續(xù)時(shí)間
高達(dá) 2 W 的輸出功率
極低的噪音
集成預(yù)補(bǔ)償色散模塊

應(yīng)用實(shí)例1

長(zhǎng)時(shí)間觀察活體細(xì)胞過程中，光損傷是限制因素之一。在實(shí)驗(yàn)過程中高平均功率的持續(xù)照射對(duì)細(xì)胞本身產(chǎn)生很大影響。不過，對(duì)光毒性敏感的活細(xì)胞來說，低平均功率、小于50fs的脈沖寬度、極高的峰值功率，既減少了對(duì)細(xì)胞的損傷、又大大延長(zhǎng)了成像時(shí)間。

例如下表統(tǒng)計(jì)所示：VALO 50fs與傳統(tǒng)200fs進(jìn)行比較，同峰值功率只需要輸出1/4的激光功率，換句話來講，成像相同質(zhì)量情況下，成像效率是傳統(tǒng)200fs激光光源的4倍！同時(shí)，相比傳統(tǒng)200fs而言，還能擁有更長(zhǎng)的成像時(shí)間，為了降低光毒性的影響，更低的重復(fù)頻率光源是首選。總的來說，VALO激光器具備這樣的優(yōu)勢(shì)條件。

VALO激光器與傳統(tǒng)激光器參數(shù)對(duì)比

下圖顯示了使用VALO系列＜50fs脈沖激光器在沒有組織損傷的情況下進(jìn)行髓鞘形態(tài)的多光子成像和長(zhǎng)時(shí)間延時(shí)采集(超過一小時(shí))。觀察到脫軸和脫軸髓鞘膜可以研究鈉離子通道在多發(fā)性硬化(MS)疾病中的作用。

隨著鈉離子濃度持續(xù)提高，進(jìn)而誘導(dǎo)髓鞘腫脹 得到的延時(shí)成像

應(yīng)用實(shí)例2

如下圖所示，顯示了來自校準(zhǔn)網(wǎng)格的三次諧波信號(hào)，樣品的平均功率為4.7mW，具有VALO系列飛秒激光器的全帶寬，產(chǎn)生約40fs脈沖。在圖b）中，激光器的光譜帶寬被限制在1064nm附近的10nm FWHM，產(chǎn)生約160 fs的脈沖。圖a）和圖b）中的圖像具有相同的比例，但圖b）中沒有顯示THG信號(hào)。只有在從較長(zhǎng)的~160fs脈沖中重新縮放較低的THG信號(hào)后，才有可能獲得高于實(shí)驗(yàn)噪聲基底的圖像，如圖c）所示。在這種情況下，需要高2.5倍的平均激光功率來實(shí)現(xiàn)與從較短的50 fs以下脈沖獲得的THG信號(hào)的信噪比相當(dāng)?shù)男旁氡葋韺?shí)現(xiàn)。總之，小于50fs脈沖提供了相當(dāng)高的脈沖峰值功率，這導(dǎo)致了在低得多的平均功率下的最佳信噪比圖像，這反過來減少了光漂白，并延長(zhǎng)了細(xì)胞活力。

50μm²的校準(zhǔn)網(wǎng)格(ibidi) 的三次諧波。
a)47mW，全譜短脈沖 (<50fs;VALO系列)
b)6mW 光光譜限制在10nm帶寬 (~160fs)
c)6mw的激光光譜限制在10nm帶寬(~160fs)

展望

多光子顯微鏡在各種應(yīng)用中具有巨大的潛力，包括開發(fā)未來的診斷篩查系統(tǒng)。VALO系列飛秒激光器在50 fs以下范圍內(nèi)提供脈沖，并提供前所未有的多光子轉(zhuǎn)換效率和強(qiáng)大的峰值功率。這反過來又有助于推動(dòng)無標(biāo)簽多光子應(yīng)用的前沿，特別是在三次諧波成像中，因?yàn)樗軌驅(qū)崿F(xiàn)高靈敏度的擴(kuò)展活細(xì)胞成像和延時(shí)測(cè)量。

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